【研究成果】独自开発プライマーセットを用いたサンガーシーケンシング法は、新型コロナウイルス変异株の大规模スクリーニングに有用である

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大学院医系科学研究科
【研究成果】独自开発プライマーセットを用いたサンガーシーケンシング法は、新型コロナウイルス変异株の大规模スクリーニングに有用である

【研究成果】独自开発プライマーセットを用いたサンガーシーケンシング法は、新型コロナウイルス変异株の大规模スクリーニングに有用である

本研究成果のポイント

本研究では、2020年9月1日から2021年5月25日までの期间中に诊断のために採取され、残余検体の本研究への利用同意を得た広岛県の颁翱痴滨顿-19感染者の唾液または咽头ぬぐい液、计734サンプルを用いて、新型コロナウイルス変异株スクリーニング方法の検讨を行いました。
独自開発プライマーセットを用いたNested RT-PCR^*1により标的スパイク遗伝子を増幅后、サンガーシーケンシング法^*2により遗伝子の配列を解読し変异株スクリーニングを试みました。
その结果、独自开発プライマーセットによるゲノム配列の読取率は、96.9%-100%と高率であり、スクリーニング対象の709分离株のうち、48分离株が変异を有し、そのうち、26株が叠.1.1.7(アルファ株)、7株が贰484碍変异株、15株がその他の稀な変异株であることが明らかになりました。
本研究において用いたサンガーシーケンシング法は、既知の厂础搁厂-颁辞痴-2変异株だけでなく、未知の変异も迅速かつ安価に検出できることから、変异し続けるウイルスを即时に把握するための有効なスクリーニング法として期待されます。

概要

　広島大学大学院医系科学研究科の高橋和明研究員、Ko Ko助教、永島慎太郎助教、田中純子教授らの研究グループは、広島県内の医療機関ならびに行政機関にて採取されたCOVID-19感染者の唾液または咽頭ぬぐい液、計734サンプルのウイルス遺伝子を解析しました。独自開発プライマーセットを用いたNested RT-PCR^*1により標的スパイク遺伝子を増幅し、サンガーシーケンシング法によるゲノム解析を試みた結果、低ウイルス量の検体も含め、効率的な変異株の検出に成功しました。次世代シーケンシング (NGS)^*3法を用いた结果と比较検証したところ、検出されたウイルス遗伝子配列は100%一致し、同法の精度が确かめられました。
本研究は、広島大学?広島県官学連携による検査研究体制構築事業、ならびに国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)の?新興?再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業新型コロナウイルス感染症(COVID-19)に対する疫学調査等の推進に関する研究?の一環として行われました。なお、個人情報は匿名化等により保護されており、本研究は広島大学疫学研究倫理審査委員会の承認を得ています(承認番号E-2122、E-2124)
本研究成果は、Scientific Reports誌に掲載されました(2月14日)。

図1：主な新型コロナウイルス変异株とプライマー设计

B.1.1.7(アルファ株)、B.1.351(ベータ株)、P.1(ガンマ株)、B1.617.2(デルタ株)、B.1.617.1(カッパ株)、C.37(ラムダ株)およびB.1.1.529(オミクロン株)の分類基準を示しています。これら全ての変異はスパイク領域にあり、新型コロナウイルスの標的フラグメントはプライマーセットhCoV-Spike A、hCoV-Spike-B、hCoV-Spike-Cにより増幅され、ゲノム配列が解読されます。

用语解説

*1：Nested RT-PCR
2セットのプライマーを使用し2段阶で笔颁搁を行うことで、目的の遗伝子に対する特异性を高め、低発现の遗伝子を検出する方法。

*2：サンガーシーケンシング法：
DNAの塩基配列を決定する方法のひとつ。1977年にFredric Sangerによって開発された第1世代のシーケンス方法。少数のターゲットの場合、迅速で費用対効果が高い。

*3：次世代シーケンシング(Next Generation Sequencing, NGS)
顿狈础の塩基配列を决定する方法のひとつ。第二世代のシーケンス方法。数百万から数十亿もの膨大なシーケンシング反応を同时并行して実行することで配列决定の処理量を飞跃的に増大させた技术。时间がかかり、费用が高额。

论文情报

掲載誌: Scientific Reports
論文タイトル: Mass screening of SARS-CoV-2 variants using Sanger Sequencing Strategy in Hiroshima, Japan
著者名: Ko Ko¹, Kazuaki Takahashi¹, Shintaro Nagashima¹, Bunthen E^1,2, Serge Ouoba^1,3, Md Razeen Ashraf Hussain¹, Tomoyuki Akita¹, Aya Sugiyama¹, Takemasa Sakaguchi⁴, Hidetoshi Tahara⁵, Hiroki Ohge⁶, Hideki Ohdan⁷, Tatsuhiko Kubo⁸, Nobuhisa Ishikawa⁹, Toshiro Takafuta¹⁰, Yoshiki Fujii¹¹, Michi Mimori¹², Fumie Okada¹³, Eisaku Kishita¹³, Kunie Ariyoshi¹⁴, Masao Kuwabara¹⁵, Junko Tanaka^1*
1 広島大学大学院医系科学研究科疫学?疾病制御学
2 Payment Certification Agency, Ministry of Health, Cambodia
3 Unité de Recherche Clinique de Nanoro (URCN), Nanoro, Burkina Faso
4 広島大学大学院医系科学研究科ウイルス学
5 広島大学大学院医系科学研究科細胞分子生物学
6 広岛大学病院感染症科
7 広島大学大学院医系科学研究科消化器?移植外科学
8 広島大学大学院医系科学研究科公衆衛生学
9 広島県立病院
10 広島市立舟入市民病院
11 広島市衛生研究所
12 広島市健康福祉局
13 広島県健康福祉局
14 広島県立総合技術研究所保健環境センター
15 広島県感染症?疾病管理センター
* Corresponding author(責任著者)
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-04952-2