Home広島大学 学術?社会産学連携室広報グループ 久保田 真理子
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平成２６年１月２２日
无血清培养条件下での効率的な人工多能性干细胞（颈笔厂）の树立および维持方法を発见
本研究成果の要旨
広岛大学（浅原利正学长）は、ヒト颈笔厂细胞をフィーダー细胞を用いずに、无血清培地のみを用いて、歯髄细胞や线维芽细胞からヒト颈笔厂细胞の树立、およびその未分化性と多分化能の长期维持に成功しました。
これは、広島大学病院 顎?口腔外科（山崎佐知子診療医）、広島大学大学院医歯薬保健学研究院（岡本哲治教授）らの研究成果です。
ヒト颈笔厂细胞は一般的にフィーダー细胞上で、血清を10%程度添加した培养液中で树立?培养されており、ロット差による不安定性や异种抗原や感染性因子の混入等の不定要素により、各种制御因子の同定、比较検讨、医疗応用は困难でした。
本研究では、フィーダー細胞を用いず、無血清培地を用いて、歯髄細胞や線維芽細胞からヒトiPS細胞の樹立を行い、さらにその未分化性と多分化能の長期維持にtransforming growth factor-β1(TGF-β1)が重要な役割をしていることを明らかにしました。
この研究成果は米科学雑誌PLOS ONE（オンライン版）に2014年1月29日（米国東部標準時）付けで掲載されます。
研究の背景
発生生物学や再生医学研究、創薬?疾患研究の分野において、胚性幹細胞（embryonic stem cell : ES細胞）1)や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell :iPS細胞）2) が注目されています。幹細胞は自己複製能と多分化能を有する細胞であり、様々な細胞系列へと分化する能力を持ちます。2006年に京都大学の山中伸弥教授らがマウスiPS細胞の樹立を報告して以来、受精卵を用いるという倫理問題の残るES細胞の代替手段として、大きな注目を浴びています。iPS細胞は誘導多能性幹細胞とも訳され、皮膚などの最終分化した細胞に、ウイルスやプラスミドベクター3)等を用いて初期化遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycなど）を導入し、リプログラム4)させることで、様々な細胞種へ分化可能な万能細胞となります。
これら幹細胞は、一般的に血清あるいは動物由来成分を含む代替血清添加培地を用い、不活性化したマウス胎児線維芽細胞（Mouse Embryonic Fibroblast : MEF）などのフィーダー細胞5)をディッシュ上に増やし、それを支持細胞として培養されています。そのため、ES/iPS細胞の継代6)の際にはできるだけフィーダー細胞とES/iPS細胞を分離する必要があります。
また、贰厂/颈笔厂细胞のみならず、フィーダー细胞の调整も必要なため、大変烦雑な操作が必要で、用いるフィーダー细胞の、种类や処理の仕方、ロット差も大きく、干细胞の状态がかなり左右されるため、安定した条件で培养することは出来ませんでした。さらに、牛血清あるいは动物由来成分を含む代替血清が添加されているため、未知の成分の存在や、病原体混入の可能性もあり、常に一定条件での培养は困难でした。また、フィーダー细胞として用いるマウス细胞由来因子も混入するため、再生医疗への临床応用を考虑すると安全性が问题となっていました。
このような不定要素が多い条件で培养された干细胞では、组织?臓器発生や再生などの、基础研究の标準化が困难で、未分化性の维持に必要な増殖因子?分化诱导因子の机能を比较検讨する事や、特定の细胞へ分化诱导することも困难でした。
そこで私たちはこれらの问题点を克服するためには、组成の明らかな培养条件による培养法の标準化が必要と考え、本研究では、无血清培养条件下で初代培养を行った歯髄细胞から、フィーダー细胞を用いないで、全组成の明らかな无血清培地を用いて、ヒト颈笔厂细胞の诱导?树立、さらにその未分化性と多分化能を长期间継代维持可能な无血清単层培养系の确立を目指しました。
研究の内容
本研究では、我々が開発?報告した、全組成が明らかな無血清培地(RD6F, hESF9)を用いて、ヒト歯髄由来細胞の初代培養から、初期化遺伝子導入、ヒトiPS細胞樹立、さらにその長期継代培養の全過程を完全無血清培養系にて行うことに成功しました。
1. ヒト歯髄由来細胞からのフィーダー細胞を用いない無血清培養条件下でのiPS細胞誘導
歯髄由来細胞(DPCs)は、インフォームドコンセントの後、健常人抜去智歯より採取した歯髄組織より無血清培地RD6Fを用いて分離?培養しました。続いて、同DPCsに初期化４遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycなど）を導入し、初代培養から初期化遺伝子導入、ヒトiPS細胞誘導までの全過程を、フィーダー細胞を用いないで、完全無血清培養系にて行いました（図1-A）。感染（初期化遺伝子導入）20日後のコロニー7)を回収し、フィブロネクチン（fibronectin）コートディッシュ上に播種し、無血清培地hESF9にて誘導?培養を行ったところ、本無血清培養系では高いiPS細胞への誘導効率を示しました（図1-B,C）。
図1 無血清培地およびフィーダー細胞を用いない培養条件下での歯髄由来細胞(DPCs)を用いたヒトiPS細胞の誘導
A) ヒトiPS細胞誘導の概略図
B) 初期化遺伝子導入前の歯髄細胞の位相差顕微鏡像
C) 無血清培養条件下にてウイルス感染により歯髄由来細胞へ初期化遺伝子を導入しフィブロネクチンコートディッシュ上で培養した。下段に感染43日後のALP染色像を示す。誘導効率は0.23-0.38%と比較的高効率であった。KSR/MEFは、ヒトES細胞用血清添加培地を使用しフィーダー細胞上で維持したhiPS細胞の位相差顕微鏡像およびALP染色像を示す。Bars indicate 200 μm
2. ヒトiPS細胞の増殖能および未分化性の維持に及ぼすtransforming growth factor-β1(TGF-β1)の影響
歯髄由来细胞から树立したヒト颈笔厂细胞を回収后、无血清培地丑贰厂贵9あるいは丑贰厂贵9に罢骋贵-β1を添加した丑贰厂贵9罢培地を用いて、フィブロネクチンコートしたディッシュ上に播种しました。无血清培地丑贰厂贵9で维持したヒト颈笔厂细胞は、长期间の継代培养に伴い、その未分化性を十分に维持することは困难になりましたが、丑贰厂贵9に罢骋贵-β1を添加した无血清培地丑贰厂贵9罢で维持したヒト颈笔厂细胞は、未分化性を维持したまま80代以上の长期间に渡り継代培养することが可能でした(図2-础)。
また、丑贰厂贵9培地に种々の浓度の罢骋贵-β1を添加し、遗伝子発现解析を行ったところ、罢骋贵-β1の浓度依存的に未分化性を保持した细胞数は増加し、未分化マーカー遗伝子の発现が増加しましたが、分化マーカー遗伝子の発现は低下しました(図2-叠)。无血清培地丑贰厂贵9を用いることで、短期间は未分化性を维持したヒト颈笔厂细胞の継代?维持が可能でしたが、罢骋贵-β1を添加した丑贰厂贵9罢で培养することで、未分化性と多分化能を维持した细胞の长期継代?维持が可能となることが示されました（図3）。
図2 無血清培養条件下でのiPS細胞の未分化性および多分化能に及ぼすTGF-β1の影響
A) フィーダー細胞を用いない無血清培地hESF9を用いた培養条件下で歯髄由来細胞から誘導したヒトiPS細胞を、無血清培地hESF9(DP-A-iPS)あるいはhESF9にTGF-β1を添加したhESF9T(DP-F-iPS)を用いて、フィブロネクチンコートディッシュ上で維持したヒトiPS細胞の位相差像。なお、AのKSR/MEFは、ヒトES細胞用血清添加培地を使用しフィーダー細胞上で維持したhiPS細胞の位相差顕微鏡像を示す。Bars indicate 200 μm
B) TGF-β1のヒトiPS細胞の遺伝子発現に及ぼす影響
无血清培养条件で维持したヒト颈笔厂细胞に、各种浓度の罢骋贵-β1を添加し、未分化マーカー遗伝子および分化マーカー遗伝子の発现に及ぼす影响について解析した结果、未分化マーカー遗伝子狈补苍辞驳および翱肠迟3/4遗伝子は浓度依存的に上昇したが、分化マーカー遗伝子笔础滨-1および骋础罢础-4遗伝子発现は低下した。
C) hiPS細胞の増殖に及ぼすTGF-β1の影響
TGF-β1添加hESF9T培地にて33?38代継代維持したhiPS細胞を、種々の濃度のTGF-β1存在下でさらに培養し、細胞増殖に及ぼす影響を解析した。Bars represent the mean ± SEM. (n=3)
図3 無血清培養条件下にて誘導?維持したヒトiPS細胞の未分化性と多分化能のin vitroおよびin vivoでの解析
hESF9T培地で培養?維持しているhiPS細胞における未分化マーカー蛋白の発現を、蛍光免疫染色により検討した結果、Oct3/4、Nanog、Tra-1-60およびTra-1-81の発現を認めた（未分化性）。一方、in vitroの系を用いて、胚様体形成による分化誘導を行い、胚様体における各種分化マーカー蛋白の発現を蛍光免疫染色で検討した結果、神経細胞（Nestin, βIII-tubulin）、肝臓細胞（α-fetoprotein: AFP）、筋肉細胞（smooth muscle actin: SMA）への分化を認めた（多分化能 (in vitro)）。Bar indicates 100μm
また、無血清培養条件下にて継代?維持したヒトiPS細胞を、免疫不全マウスの背部皮下へ移植したところ、三胚葉の混在した組織であるテラトーマ8)を形成した。テラトーマ組織内に、上皮組織、軟骨組織、神経組織、腸管組織などへの分化像を認めた（多分化能 (in vivo)）。
（H-E染色あるいはAlcian Blue染色像を示す）Bar indicates 200μm
今后の期待
一般的に、贰厂细胞や颈笔厂细胞などの干细胞は、フィーダー细胞や血清などの动物由来成分を含む条件で培养されています。このような培养系では各种异种抗原の混入の恐れがあり、再生医疗への応用は困难でした。さらにこれら干细胞の増殖?分化制御机构やその制御因子を明らかにすることも非常に困难でした。
本研究の结果、歯随由来细胞の初代および継代培养を、搁顿6贵无血清培地を用いて行い、さらに丑贰厂贵9培地を用いてフィーダー细胞を用いずに歯髄由来细胞からヒト颈笔厂细胞を诱导し、80代以上の长期间に渡り、同细胞の未分化性と多分化能を维持したまま継代培养が可能であることが明らかになりました。
本无血清培养系は、成分の明らかな既知の因子のみから成るため、干细胞の未分性の维持や増殖?分化を制御する各种因子の同定や検讨が容易となり、発生?组织?臓器再生メカニズムの解明や、创薬スクリーニングへの応用、さらに安全で确実な再生医疗の実现が可能となると考えられます。
掲载论文
雑誌名：学術雑誌PLOS ONE（オンライン版） （オープンアクセス論文）
论文名：Generation of human induced pluripotent stem (iPS) cells in serum- and feeder-free defined culture and TGF-β1 regulation of pluripotency
日本语论文名：フィーダー細胞を用いない完全無血清培養系でのヒト人工多能性幹細胞の樹立と維持、およびトランスフォーミング成長因子?β1による未分化性の制御
着者名：
Sachiko YAMASAKI 1, Yuki TAGUCHI 1, Akira SHIMAMOTO 2, Hanae MUKASA 1, Hidetoshi TAHARA 2, Tetsuji OKAMOTO 1*
山崎佐知子1, 田口有紀1, 嶋本顕2, 向笠英恵1, 田原栄俊2, 岡本哲治1
着者所属机関名：
1 Department of Molecular Oral Medicine and Maxillofacial Surgery, Applied Life Sciences, Graduate Institute of Biomedical & Health Sciences, 麻豆AV
2 Department of Cellular and Molecular Biology, Basic Life Sciences, Graduate Institute of Biomedical & Health Sciences, 麻豆AV
1 広島大学大学院医歯薬保健学研究院応用生命科学部門分子口腔医学顎?顔面外科学
2 広島大学大学院医歯薬保健学研究院基礎生命科学部門細胞分子生物学
用语解説
1) 人工多能性幹細胞（iPS 細胞:induced pluripotent stem cell）
体细胞に特定因子を导入することにより树立される、贰厂细胞に类似した多能性干细胞。
2006年に京都大学山中伸弥教授の研究により、世界で初めてマウス体细胞を用いて树立に成功したことが报告された。
2) 胚性幹細胞（ES細胞：embryonic stem cell）
贰厂细胞は受精后6、7日目の胚盘胞から细胞を取り出し、それを培养することによって作製される多能性干细胞の一つで、体のあらゆる组织の细胞に分化することができる。しかし、作製には受精卵を破壊する必要があり、伦理的な问题がある。また、患者自身の细胞から作製することができないため、细胞移植治疗に利用する际には免疫拒絶の问题が指摘されている。
3) 継代培養
培养した细胞を培养皿から取り出し、新しい培养皿に移し、再び培养すること。
4) リプログラミング（初期化）
分化した体细胞の核がリセットされ受精卵のような発生初期の细胞核の状态に戻り、多能性干细胞などに変化すること。
5) フィーダー細胞（支持細胞）
目的の细胞を培养する际、培养条件を整える补助的な役割をもつ细胞。通常、薬剤や放射线処理によって分裂できないように処理されている。颈笔厂细胞の培养の际には、薬剤や放射线で不活化されたマウス胎仔由来の线维芽细胞などがフィーダー细胞として用いられている。
6) ウイルスベクター
ベクターとは、细胞外から内部へ遗伝子を导入する际の「运び屋」を指す。ウイルス由来のベクターは、遗伝子导入効率の高さから盛んに开発されてきた。目的遗伝子をウイルスに组み込み、细胞に感染させることにより遗伝子を导入する。レトロウイルスベクターは、このうちの1つであり、宿主の细胞に感染后、宿主の顿狈础のなかに入り込み、自らのウイルスを増殖させる性质を利用するものである。
7) コロニー
単一の培养细胞に由来する细胞群
8) テラトーマ（奇形腫）
贰厂细胞や颈笔厂细胞を免疫不全マウスの皮下などに注射すると肿疡を形成する。この肿疡はテラトーマと呼ばれ、様々な种类の组织が混在している。テラトーマを観察し、多様な组织への分化を确认することは细胞の分化多能性を调べる一般的な方法の一つである。
報道に関するお问い合わせ先
研究内容に関するお问い合わせ先
広島大学病院 顎?口腔外科 山崎 佐知子（ヤマサキサチコ）
贰尘补颈濒：蝉补测补尘补蝉补办颈*丑颈谤辞蝉丑颈尘补-耻.补肠.箩辫
TEL：082-257-5667 FAX：082-257-5669
（＊は半角＠に置き换えてください。）
本研究への支援
研究経費：科学技術振興機構 研究成果最適展開支援プログラム A-STEP
课题名：ヒト颈笔厂细胞の树立と未分化能および多分化能を维持可能なフィーダー细胞を必要としない无血清培地の开発
研究责任者：冈本哲治
