平成２７年３月２６日
国立大学法人 広島大学
学校法人 龍谷大学
国立大学法人 神戸大学
次世代顿狈础定量法を用いた环境顿狈础による鱼类生物量?个体数の推定
－迅速?简便な水生生物の量?数の把握が可能に！－
広岛大学サステナブル?ディベロップメント実践研究センターの土居秀幸特任讲师、龙谷大学の山中裕树讲师、神戸大学の源利文特命助教らは、次世代顿狈础定量法の1つであるデジタル笔颁搁法を用いて、水の中に溶けている顿狈础から鱼类生物量?个体数を推定する手法を开発しました。デジタル笔颁搁法（図１）とは、顿狈础サンプルを油膜で区切られた２万个の小さな（２ピコリットル）粒（ドロップレット）に小分けして分析する手法です。
デジタル笔颁搁法を用いてコイの顿狈础量を测定することで、従来のリアルタイム笔颁搁法などの手法よりも、高精度に鱼（コイ）の生物量（水槽内の重さ）と个体数（水槽内の数）を推定できることがわかりました。
本研究成果は、３月２３日（月）（米国東部標準時９時）付けで米国Public Library of Scienceの科学雑誌『PLOS ONE』にオンラインで掲載されました。
论文名："Use of droplet digital PCR for estimation of fish abundance and biomass in environmental DNA surveys."
著 者：Doi,H., Uchii,K., Takahara,T., Matsuhashi,S., Yamanaka,H.,Minamoto,T.
水域にどのような种类の鱼がどのくらい生息しているのかを调べるためには、これまでは网などで実际に鱼を捕まえたりする必要があり、多くの时间や労力を要しました。湖や河川などの水には、鱼のフンやはがれ落ちたうろこなどから出た顿狈础（环境顿狈础）が浮游しています。これらの环境顿狈础を用いて、鱼类などの大型生物の生息分布や生物量を推定する手法を、近年、土居特任讲师?山中讲师?源特命助教らのグループで开発しています。また、２０１２年には、同研究グループで従来の定量法であるリアルタイム笔颁搁を用いた定量法を开発?発表しています。
土居特任讲师らの研究グループは、コイを用いて、野外実験水槽（约５００リットル）による操作実験を行いました。１２个の水槽に、３匹?８５匹まで様々な数のコイを入れて饲育しました。その饲育水から１５ミリリットルの水をとって、环境顿狈础を採集し、顿狈础断片を増幅?定量できる「デジタル笔颁搁法」を用いて、コイの生物量（重さ）や个体数（数）に比例して、コイの顿狈础の浓度が高くなることを明らかにしました（図２）。また、１、２、３日の実験日でも同じような倾向が得られました。
本研究では、顿狈础採集手法を改善し、さらにデジタル笔颁搁法を用いた测定を导入することにより、顿狈础量が少ない场合には、２０１２年に発表した手法に比べ、定量误差を最大1/5?1/10に低减することができました。これにより、野外においても生物量?个体数などの定量がより正确にできるようになると考えられます。
本研究では、わずか15ミリリットルの水から顿狈础の浓度を调べることで、鱼の生息状况（特に生物量、重さ）を简便かつ迅速に推定できる手法を开発しました。今后は、本研究によって确立した环境顿狈础定量手法を、野外での生物量の把握へと応用することが考えられます。また、希少种、外来种に特异的な顿狈础をターゲットとすることで、それらの生物の生息状况の调査へと応用することも期待できます。
(*1)デジタル笔颁搁法：デジタル笔颁搁法とは、顿狈础サンプルを油膜で区切られた２万个の小さな（２ピコリットル）粒（ドロップレット）に小分けして分析する手法です。ドロップレット内で、ターゲットとする生物种の顿狈础を、笔颁搁（合成连锁反応）により特异的に増やします。ドロップレット内で顿狈础が増幅すると、蛍光を発するようになります。その蛍光をひとつのドロップレットごとに测定することで、各ドロップレット内にターゲット种の顿狈础がはいっているか、いないかを１、０で判别します。１と判别されるドロップレットの数によって、顿狈础の量を定量します。０か１で判别するため”デジタル”笔颁搁法と呼ばれています。
図１ デジタルPCR測定装置（Biorad QX-100)
図２ 水槽内のコイに特異的な環境DNA量と個体数（匹数）の関係
プロットの色の违いはサンプリング日（実験１、２、３日目）の违いを示す。
広岛大学サステナブル?ディベロップメント実践研究センター
特任講師 土居秀幸（どい ひでゆき）
TEL/FAX: 082-424-5732
E-mail: doih*hiroshima-u.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
龙谷大学理工学部环境ソリューション工学科
講師 山中 裕樹（やまなか ひろき）
E-mail: yamanaka*rins.ryukoku.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
神戸大学大学院人间発达环境研究科
特命助教 源 利文（みなもと としふみ）
TEL/FAX: 078-803-7743
E-email: minamoto*people.kobe-u.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
広島大学 学術?社会産学連携室広報グループ 三戸 里美（みと さとみ）
TEL: 082-424-3701 FAX: 082-424-6040
Email: koho*office.hiroshima-u.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
龍谷大学 学長室（広報） 鈴木 隆文（すずき たかふみ）
TEL: 075-645-7882 FAX: 075-645-8692
E-mail: kouhou*ad.ryukoku.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
神戸大学 広報室 赤松 朋広（あかまつ ともひろ）
TEL: 078-803-5453 FAX: 078-803-5088
E-mail: ppr-kouhoushitsu*office.kobe-u.ac.jp（*は半角@に変更して送信してください。）
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