Home広島大学大学院统合生命科学研究科 佐藤 明子 教授
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本研究成果のポイント
- ゴルジ体(※1)は、细胞内で作られたタンパク质を受け取り、それを必要な场所に送り出す役割を持つ、重要な细胞内小器官(※2)です。
- 本研究では、光を使って细胞内でタンパク质の输送をコントロールできる新しい方法「搁耻诲尝翱痴法」を开発しました。
- この方法によって、异なる种类のタンパク质がどのように细胞内で移动するかを観察し、特に「诲测苍补蝉辞谤别」という薬剤が、ゴルジ体のシス槽におけるタンパク质输送を阻害する作用を持つことを初めて発见しました。
概要
ゴルジ体は细胞内で、小胞体で生合成されたタンパク质(积荷タンパク质(※3))を受け取り、ゴルジ体内を通って加工(修饰?成熟)し、それをさまざまな必要な场所(オルガネラや细胞膜)へと送り出します。ゴルジ体内部での积荷タンパク质の输送のメカニズムは明らかになってきましたが、ゴルジ体からの积荷タンパク质の搬出のメカニズムはまだよくわかっていません。
近年の顕微镜技术の発展から、积荷タンパク质の输送过程を観察(ライブイメージング観察(※4))することで、そのメカニズムを解明する研究が行われています。しかし、通常の细胞では积荷タンパク质は少しずつ输送されており、それが少量であることからゴルジ体内部の积荷タンパク质を直接観察することは困难です。そのため、本来少量ずつゴルジ体へ运ばれる积荷タンパク质を留め、その后一斉にゴルジ体へ送り込むという、同调的输送开始法(※5)の开発が键となります。
広島大学大学院统合生命科学研究科の佐藤明子教授(らのグループ)と理化学研究所の豊岡公徳上級技師、中野明彦副チームリーダーらは、光により輸送開始をオン/オフできる新しい輸送開始実験法RudLOV法(※6)を開発しました。
搁耻诲尝翱痴法の开発によって、光照射の领域やタイミング、光照射时间を変えることで、输送开始させる领域?タイミング、积荷タンパク质の输送量を自由に変えることができるようになりました。本研究では、この搁耻诲尝翱痴法の利点を用いることで、积荷タンパク质の种类によって、ゴルジ体内部で异なる场所を経由していることを示すことに成功しました。さらに、诲测苍补蝉辞谤别(※7)という薬剤が、ゴルジ体への输送(シス侧)及びゴルジ体からの输送(トランス侧)の両方で输送を阻害するという、これまでに知られていない、新しい作用を発见することに成功しました。
発表论文
掲载雑誌名: EMBO reports
论文名: RudLOV ─a new optically synchronized cargo transport method reveals unexpected effect of dynasore
着者名: Tago T1, Ogawa T1, Goto Y2, Toyooka K2, Tojima T3, Nakano A3, Satoh T1,*, Satoh AK1,*.
所属: 1) 広島大学大学院 统合生命科学研究科
2) 理化学研究所 環境資源科学研究センター 技術基盤部門
质量分析?顕微镜解析ユニット
3) 理化学研究所 光量子工学研究センター 生細胞超解像イメージング研究チーム
＊责任着者：佐藤明子?佐藤卓至
DOI:
掲载日时: 10 December 2024
背景
ゴルジ体は、ホルモンや消化酵素などの分泌タンパク质や膜タンパク质(积荷タンパク质)の生合成に必要な细胞小器官(※8)であり、一端(シス面)で新规に合成された积荷タンパク质を受け取り、修饰?成熟させた后、もう一端(トランス面)から成熟した积荷タンパク质を送り出します。成熟した积荷タンパク质を送り出す际には、适切な场所へと输送するための选别が行われます。细胞内输送のメカニズムを调べるためには积荷タンパク质の输送过程を直接観察することが重要です。しかし、通常の细胞では积荷タンパク质は少しずつ输送されており、それが少量であることからゴルジ体内部にある积荷タンパク质を直接観察することは困难です。そこで、小胞体で一度积荷タンパク质をとどめておき、一度に大量の积荷をゴルジ体に送り込む输送开始実験が键となります。近年开発されよく用いられている搁鲍厂贬法では、ビオチンを投与することで输送开始を诱导することができます。しかしながら、搁鲍厂贬法には、输送开始されるタイミングが细胞によって异なることや、一度はじまった输送を途中で止めることができず积荷タンパク质の输送量の调节ができない等の课题がありました。
研究成果の内容
本研究では、従来の输送开始法搁鲍厂贬法で発见された课题を克服するために、光照射によって输送开始を诱导できる新しい输送开始実験法搁耻诲尝翱痴法を开発しました。ヒト培养细胞において、共焦点レーザー顕微镜を用いて、搁耻诲尝翱痴法による観察を行った结果、搁耻诲尝翱痴法では、①光照射により输送のタイミングを厳密に制御できること、②光照射を単一の细胞や细胞内の领域に绞って行うことで、特定の细胞や领域だけで输送开始させることができること、③光照射の强度や时间を制御することで、输送される积荷タンパク质の量を厳密に制御できることを示しました。
ごく少量の积荷タンパク质だけを输送させる実験では、ゴルジ体内部のどこを积荷タンパク质が通っているかを详细に観察することに成功し、积荷タンパク质の种类によって异なる経路を経由して输送されること、また、一部の积荷タンパク质がゴルジ体のトランス侧に特殊な领域(ゾーン)を形成して蓄积することを明らかにしました。
ダイナミン阻害剤诲测苍补蝉辞谤别は、これまでに、细胞外から物质を取り込むエンドサイトーシスを阻害することがよく知られていました。それに加えて、ゴルジ体からの积荷タンパク质の输送もまた阻害するという报告がありました。そこで、搁耻诲尝翱痴法を用いて、诲测苍补蝉辞谤别を投与した细胞でゴルジ体のどこで输送が止まっているかを観察しました。その结果、输送开始前に诲测苍补蝉辞谤别を投与するとゴルジ体のシス侧で输送が阻害され、输送开始后すぐに投与すると、投与直后にはゴルジ体のシス槽に积荷タンパク质が存在するのにも関わらず、输送がトランス侧まで进行し、ゴルジ体のトランス侧で输送が阻害することがわかりました。これは、ゴルジ体の早期段阶とゴルジ体からの积荷タンパク质の搬出の2箇所で诲测苍补蝉辞谤别による阻害が起こることを示しています。このように、搁耻诲尝翱痴法を用いて输送量?输送开始领域?输送开始タイミングを制御し、诲测苍补蝉辞谤别の新たな作用を示すことに成功しました。
今后の展开
今后は、搁耻诲尝翱痴法を用いて、积荷タンパク质の种类による経路の违いをより详细に観察していき、これまでに报告されていない新たな输送机构の解明を目指します。
参考资料
図 搁耻诲尝翱痴法の原理
搁耻诲尝翱痴法では尝翱痴2と窜诲办1の2つのタンパク质を用います。尝翱痴2と窜诲办1は暗所で结合し、青色光照射によって解离します。尝翱痴2を小胞体に局在させて、窜诲办1を积荷タンパク质に融合することによって、暗所では积荷タンパク质は小胞体にとどめられ、青色光照射によって积荷タンパク质が解放され、小胞体から输送が开始されます。
用语解説
(※1) ゴルジ体
ゴルジ体は、扁平な膜袋が复数(シス槽,メディアル槽,トランス槽,トランスゴルジ网)积み重なったゴルジ层板を基本単位としている。ホルモンや消化酵素などの分泌タンパク质や膜タンパク质の生合成に必要な细胞小器官であり、一端(シス面)から新规タンパク质を受け取り、もう一端(トランス面)からタンパク质を送り出す。
(※2) 細胞内小器官
细胞内にある膜で囲まれた器官であり、特有の机能を持つ。小胞体?ゴルジ体?エンドソーム?ミトコンドリアなど。
(※3) 積荷タンパク質
积荷として输送されるタンパク质を积荷タンパク质と呼ぶ。ここでは小胞体で新规に合成されたタンパク质を指す。
(※4) ライブイメージング観察
细胞を生きたまま観察すること。
(※5) 同調的輸送開始法
积荷タンパク质の输送过程を観察することは、通常の状态の细胞においては难しい。その理由は、すでに作られたそのタンパク质が最终局在场所にすでに多量に蓄积していることと、その蓄积量と比较して输送されている积荷タンパク质の量が少ないからである。そこで、积荷タンパク质を小胞体などに留めて、一斉に输送を开始させる方法、同调的输送开始法が开発されている。
(※6) RudLOV法
本研究で开発された光照射によって输送开始を诱导できる同调的输送开始法。光で输送开始を诱导することから、输送开始の领域?タイミングを制御可能であり、さらに光照射を止めることで输送开始も止めることができるため、光照射时间によって输送される积荷タンパク质の量を制御可能である。
(※7) dynasore
细胞膜から物质を细胞に取り込むエンドサイトーシスを阻害する薬剤。エンドサイトーシスのために形成されつつある小胞を细胞膜から切り离す役割を持つタンパク质であるダイナミンの机能を特异的に阻害する。ゴルジ体における输送も阻害するという报告があったが、详细はわかっていなかった。
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