【研究成果】中性子と水素のスピンでナノプレート状の氷结晶観测に成功―食品?医薬品?细胞组织の冻结保存技术开発への贡献に期待―

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【研究成果】中性子と水素のスピンでナノプレート状の氷结晶観测に成功―食品?医薬品?细胞组织の冻结保存技术开発への贡献に期待―

【研究成果】中性子と水素のスピンでナノプレート状の氷结晶観测に成功―食品?医薬品?细胞组织の冻结保存技术开発への贡献に期待―

本研究成果のポイント

食品、医薬品、生体组织などを冻结保存する际には、糖などの冻结保护剤を添加することで氷结晶の成长を抑制し、细胞や细胞小器官などの损伤を防いでいます。
しかし、従来の光学顕微镜法では数十マイクロメートルにまで成长した氷结晶しか観测できないため、分子计算で提唱されている分子レベルの成长抑制メカニズムを议论できませんでした。
そこで我々は、技术开発を进めてきた「スピンコントラスト変调中性子小角散乱法」を用いて、毒性の低い冻结保护剤として注目される糖の冻结溶液中で、核生成したばかりのナノスケールの氷结晶を観察しました。
解析の结果、高浓厚のグルコースを添加した溶液では、厚さが氷结晶の最小生成サイズとおなじ数ナノメートルしかないプレート状の氷结晶が生成することを见出しました。
このような形状は、糖が水分子を水和することで氷结晶の成长を抑制するという従来のモデルでは説明できません。糖分子が氷结晶の特定の面に强く吸着するなど、别の结晶成长抑制メカニズムを兼ね备えている可能性を示しています。
今回の研究结果は、冻结保存技术の开発のみならず、极地环境に住む生物の糖の分泌による生命维持机能の解明など、今后幅広い研究に贡献できることが期待されます。

水素原子核のスピンを入射中性子のスピン方向に対し平行?反平行に整列（偏極）させて測定した複数の中性子小角散乱曲線を解析した結果、グルコース溶液を急速凍結した際に生成した氷結晶は厚さ2－3 nmのナノプレートを形成することが判明した。

概要

　国立研究开発法人日本原子力研究开発机构（理事長　小口正範　以下、原子力機構という）物質科学研究センター?J-PARCセンターの熊田高之研究主幹、中川洋研究主幹、関根由莉奈研究副主幹らは、総合科学研究機構の大石一城次長ら、広島大学川井清司大学院统合生命科学研究科教授とともに、スピンコントラスト変調中性子小角散乱法を用いてグルコース水溶液中に生成した直後の氷結晶の特異な形状を観測することに初めて成功しました。

　コップの水を0℃以下に冷やすと氷が出来ます。しかし、0℃をまたいだ途端にコップの水全体が氷になるわけではありません。水の中に生成したナノサイズの氷结晶の核は周囲の水分子を取込みながら大きな块へと成长します。水を多く含む食品、医薬品、生体组织を冻らせて保存する场合、この氷结晶の成长により细胞膜や细胞小器官などが破壊されてしまうことが问题になります。そこで、冻结保护剤を添加して氷结晶の成长を阻害する手法の开発が进められています^1,2。なかでも、糖は毒性の低い冻结保护剤として注目されています。

　そこで我々は、これまで開発を進めてきた「スピンコントラスト変調中性子小角散乱法」を用いて、構造科学の観点から糖による氷結晶成長の阻害メカニズムを解明できないかと考えました。中性子小角散乱法は、散乱角の小さな中性子散乱成分を解析することで散乱体のナノ構造を解析する手法です。しかしながら、従来の小角散乱法では氷結晶の散乱が他成分の散乱に隠れてしまい、氷結晶の構造情報を抽出することができませんでした。これに対し我々は、スピンコントラスト変調技術を組み合わせることにより氷結晶の散乱成分を識別できると考え、J-PARCの中性子小角?高角散乱装置 (TAIKAN) に水素核偏極装置を組み込むことでスピンコントラスト変調中性子小角散乱実験を行いました。

　実験の結果、グルコースを添加すると、生成した氷結晶は厚さが2-3 nmに対して数十nm以上の広がりをもつプレートを形成していることが分かりました。この厚さは過冷却水中で氷結晶の核が生成するために必要な大きさ（臨界径）とほぼ同じ大きさです。つまり、グルコース溶液中に生成した氷結晶の核は特定の軸方向にはほとんど成長していないことを示しています。従来、糖は周囲の水分子を束縛（水和）することで氷結晶の成長を妨げていると考えられてきました。しかし、ただ水和するだけでは氷結晶はプレート状に成長しません。本結果は、グルコースは水分子を水和するのみならず、他の凍結保護剤のように氷結晶の特定の面に強く結合して、その面方向の成長を抑えるなどの機能も兼ね備えている可能性を示しています。今後、計算科学などを組みあわせてグルコース分子や他の凍結保護剤による氷結晶成長抑制メカニズムを明らかにしていきたいと考えています。

　本研究は、原子力機構物質科学研究センターが研究全体をとりまとめ、J-PARCセンター、総合科学研究機構、広島大学大学院统合生命科学研究科と共同で研究を行ったものです。
本成果は、国际学术誌「The Journal of Physical Chemistry Letters」のオンライン公开版（8月22日（日本时间））に掲载されました。

これまでの背景?経纬

　近年、食品、医薬品、生体组织などの冻结保存技术の高度化に向けて、氷结晶の成长を抑制して细胞组织の损伤を防ぐ冻结保护剤の开発が进められています。氷结晶は水中で氷核とよばれるナノサイズの氷结晶が生成した后、まわりの水分子を取込みながら大きな块に成长します。水を多く含む食品、医薬品、生体组织を冻らせる际、この氷结晶の成长により组织が破壊されてしまい、结果として食品や医薬品の品质低下や生体组织の机能が损なわれてしまうことが大きな问题になっています。そこで、试料中に糖などの冻结保护剤を添加して氷结晶の成长を抑制する手法がとられています。これまで、糖は隣接する水分子と强く结合（水和）することで、水分子の自由度を夺い结晶成长を阻害すると考えられてきました。その一方で、不冻タンパク质などの冻结保护剤は氷结晶面に吸着することで结晶成长を阻害すると考えられています。ともに冻结保护剤でありながら、结晶成长の阻害メカニズムはこれほどにも线を引いたように二分されるのでしょうか？例えば、糖分子が氷结晶面に吸着するような结晶成长阻害メカニズムはないのでしょうか？

　このような结晶成长の阻害メカニズムを解明するために、糖と氷结晶表面の分子构造计算研究がすすめられています。同时に、光学顕微镜测定では糖の添加により过冷却水中で成长したマイクロメートル以上の氷结晶が様々な形状を作ることが报告されています。しかし、顕微镜で観察している氷结晶は糖分子の何万倍もの大きさです。分子构造论にもとづいて分子レベルで结晶成长の阻害メカニズムを议论するためには、核生成してすぐのナノスケールの氷结晶を実験的に観测する必要があります。そこで、我々が长年技术开発を进めてきた中性子と水素核のスピンによる构造解析法であるスピンコントラスト変调中性子小角散乱法（図1）を用いて、糖溶液中におけるナノメートルサイズの氷结晶の観测に挑みました。

図1&苍产蝉辫;スピンコントラスト変调中性子小角散乱法の概略図

スピンコントラスト変调法は、中性子の水素核に対する散乱が互いのスピンの向きによって大きく异なる性质を利用した构造解析法です。スピンコントラスト変调中性子小角散乱法では、スピンを揃えた中性子ビーム（偏极中性子）のスピン方向に対する试料中の水素核スピンの整列度（水素核偏极度）によって変化する复数の偏极中性子散乱から、多成分によって构成される复合材料中の复数の散乱成分を识别してそれぞれのナノ构造を决定できます。

今回の成果

　図2左は、－272℃で测定したグルコース水溶液の中性子小角散乱曲线です。中性子小角散乱実験では、散乱される中性子のカウント数（强度）を散乱角の指标である波数ごとにプロットした散乱曲线を解析することで、ナノスケールの散乱体の形状がわかります。しかし、さすがにこのようなのっぺりとした散乱曲线一本だけでは、形状を议论する前にそもそもこの散乱が何の散乱体によるものかすらわかりません。
　図2右は同试料のスピンコントラスト変调中性子小角散乱曲线です。中性子に対する水素核スピンの向きに応じて散乱曲线は非相似的に変化しました。この変化から、散乱曲线はスピンに対して散乱强度変化が小さな倾斜のきつい散乱（灰）と、スピンに対する强度変化の大きな倾斜の缓い散乱（橙）の２つの散乱成分によって构成されていることがわかりました。解析の结果、前者はガラス（アモルファス）状氷中のひび割れなどによる散乱で、后者は数十ナノメートル以上の拡がりに対して厚さが2－3苍尘しかないプレート状のナノ氷结晶の散乱であることがわかりました。この厚さは、水中で氷が结晶核を形成するのに必要な最小限の大きさ（临界径）³とほぼ同じ大きさです。つまり、この氷結晶は核生成したあと特定の軸方向にほとんど成長していないことを示しています。従来、グルコースを含めて糖は周囲の水分子を束縛（水和）することで水分子の運動を束縛して氷結晶の成長を妨げていると考えられてきました。しかし、同モデルでは氷結晶がプレート状に成長する結果を説明できません。本結果は、グルコースは水分子を水和するのみならず、氷結晶の特定の面に対して選択的に結合し、その面方向の成長を抑えるなどの機能も兼ね備えている可能性を示しています。

図2　従来法（左）とスピンコントラスト法（右）によって得られたグルコース水溶液の中性子小角散乱曲线

今后の展望

　今后、计算科学などとあわせてグルコース分子や他の冻结保护剤による氷结晶成长抑制メカニズムを明らかにするとともに、长期的には本测定法を通じて臓器?细胞?卵子や精子の冷冻保存技术の开発や、寒冷地における生物の生命维持机能の解明に贡献していきたいと考えています。

论文情报

雑誌名： The Journal of Physical Chemistry Letters
タイトル： Polarized Neutrons Observed Nanometer-Thick Crystalline Ice Plates in Frozen Glucose Solution
著者名： Takayuki Kumada,^1,2 Hiroshi Nakagawa, ^1,2 Daisuke Miura,¹ Yurina Sekine,¹ Ryuhei Motokawa,¹ Kosuke Hiroi,² Yasuhiro Inamura,² Takayuki Oku,² Kazuki Ohishi,³ Toshiaki Morikawa,³ Yukihiko Kawamura,³ and Kiyoshi Kawai⁴
所属先：１日本原子力研究開発機構物質科学研究センター、２日本原子力研究開発機構 J-PARCセンター、３総合科学研究機構中性子科学センター、４広島大学大学院统合生命科学研究科

各机関の役割

各研究者の役割は以下の通りです。
?熊田（日本原子力研究开発机构）：研究総括、中性子実験
?中川、叁浦（日本原子力研究开発机构）：试料调整、中性子実験
?関根、元川、稲村（日本原子力研究开発机构）、川井（広岛大学）：データ解析
?广井（日本原子力研究开発机构）、大石、森川、河村（総合科学研究机构）：中性子実験、データ解析
?奥（日本原子力研究開発機構）：J-PARC MLFプロジェクト研究課題総括

参考文献

1Zhang, M.; Gao, C.; Ye, B.; Tang, J.; Jiang, B. Effects of four disaccharides on nucleation and growth of ice crystals in concentrated glycerol aqueous solution. Cryobiology 2019, 86, 47-51. DOI: 10.1016/j.cryobiol.2018.12.006
2Chang, T.; Zhao, G. Ice Inhibition for Cryopreservation: Materials, Strategies, and Challenges. Adv Sci (Weinh) 2021, 8 (6), 2002425. DOI: 10.1002/advs.202002425
3Pereyra, R. G.; Szleifer, I.; Carignano, M. A. Temperature dependence of ice critical nucleus size. J. Chem. Phys. 2011, 135 (3), 034508. DOI: 10.1063/1.3613672